環(huán)形RNA的生物信息計算與應(yīng)用研究

本書介紹了環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本序列重構(gòu)和定量算法CircAST，該算法通過計算不同組織、不同疾病狀態(tài)下環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本完整的序列組成和內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及對環(huán)形RNA基于轉(zhuǎn)錄本水平的精確定量，幫助研究者更有效地篩選出具有潛在功能的環(huán)形RNA可變剪接異構(gòu)體，為更加精準(zhǔn)地全面解析環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本提供了重要的工具，對環(huán)形RNA功能的深入研究具有重要意義。
本書可供生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)等學(xué)科的研究人員參考，也可作為高等院校相關(guān)專業(yè)的教材或教學(xué)參考書。

吳靜，博士，南京醫(yī)科大學(xué)副教授，碩士生導(dǎo)師，現(xiàn)任中國人工智能學(xué)會生物信息學(xué)與人工生命專委會委員，中國計算機(jī)學(xué)會生物信息學(xué)專委會委員，中國自動化學(xué)會智能健康與生物信息專委會委員。主持和參與國家自然科學(xué)基金等項目多項，近五年發(fā)表國際國內(nèi)學(xué)術(shù)論文10余篇，指導(dǎo)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目及全國大學(xué)生數(shù)學(xué)建模競賽等學(xué)科競賽，多人次獲獎。

宋曉峰，南京航空航天大學(xué)教授。主要研究領(lǐng)域為生物信息學(xué)與計算系統(tǒng)生物學(xué)。近幾年主持國家自然科學(xué)基金一項、江蘇省自然科學(xué)基金一項，主持校級教改項目三項，參與國家或部級科研項目十多項，以一作或通訊作者在國際SCI檢索學(xué)術(shù)期刊Nucleic Acids Research, Journal of Theoretical Biology, Journal of Medical Virology, BioSystems等發(fā)表論文14篇，EI、ISTP收錄論文30多篇。多次參與組織和參加國內(nèi)國際學(xué)術(shù)會議。目前擔(dān)任：中國生物醫(yī)學(xué)物理學(xué)研究會理 事；中國電子學(xué)會生命電子學(xué)專業(yè)委員會委員；江蘇省生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會生物信息學(xué)專業(yè)委員會委員；Nucleic Acids Research, Computers in Biology and Medicine等多個國際雜志的審稿人，多個國際學(xué)術(shù)會議(WCCI2008, ACM BCB2011, BSBT2011，BSBT2010，BSBT2009，BSBT2008, IEEE BIBM2010, IEEE BIBM2011, IJCBS2009, AST2010, ICCC2010，ICCC2009)程序委員會委員，主席，分會主席等。

1.環(huán)形RNA作為明星分子，潛在功能亟待被挖掘 2.本書介紹了環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本序列重構(gòu)和定量算法CircAST 3.該算法可更有效地篩選出具有潛在功能的環(huán)形RNA可變剪接異構(gòu)體 4.該算法為更加精準(zhǔn)地解析環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本提供了重要的方法學(xué)工具

環(huán)形RNA（circularRNA，circRNA），也稱為環(huán)狀RNA，是一類經(jīng)由反向剪接事件產(chǎn)生、以共價鍵連接形成封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特殊內(nèi)源性非編碼RNA。近年來，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)形RNA廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，且已證實某些環(huán)形RNA具有重要的生物學(xué)功能，包括充當(dāng)miRNA（微RNA，小分子核糖核酸）分子海綿調(diào)控靶基因的表達(dá)、調(diào)控親本基因轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接、翻譯短肽等。同時，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)形RNA與包括癌癥在內(nèi)的多種重大疾病密切相關(guān)，有潛力成為疾病診斷的生物標(biāo)志物或治療的靶點(diǎn)。然而目前大多數(shù)環(huán)形RNA的功能仍不甚清楚，在轉(zhuǎn)錄組測序大數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上利用現(xiàn)有的計算工具對環(huán)形RNA的反向剪接位點(diǎn)進(jìn)行識別之后，進(jìn)一步獲取環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本的全長序列并對可變剪接產(chǎn)物進(jìn)行定量是環(huán)形RNA功能研究中的首要關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對理解環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本的多樣性和表達(dá)模式、篩選有潛在生物學(xué)功能的環(huán)形RNA分子具有重要的意義。雖然已有研究在這方面做出了一些有益的嘗試，但是仍存在許多亟待解決的問題。
本書針對環(huán)形RNA全長序列的組裝和定量問題提出一種新的算法，并以此開展不同組織（小鼠睪丸和卵巢）以及不同狀態(tài)的樣本（人腦膠質(zhì)瘤樣本和對應(yīng)的癌旁正常樣本）環(huán)形RNA可變剪接異構(gòu)體的相關(guān)研究，以驗證算法在不同物種、不同組織的適用性。具體內(nèi)容如下：
首先，為了解決環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本全長序列組裝問題，筆者提出一個基于多剪接圖模型的算法CircAST。該算法全面考慮環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用轉(zhuǎn)錄組測序讀段的比對信息，將環(huán)形RNA所有可變剪接事件通過多剪接圖建模，并且將環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本全長序列組裝問題轉(zhuǎn)化為擴(kuò)展的最小路徑覆蓋（EMPC）問題，解決了轉(zhuǎn)錄本組裝問題中外顯子連接不確定性的核心難題。經(jīng)模擬數(shù)據(jù)和真實數(shù)據(jù)測試，CircAST算法在組裝環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本時有著較好的表現(xiàn)，在與CIRCexplorer2、CIRI-full等同類工具的比較中，也表現(xiàn)出較好的性能。
接著，針對環(huán)形RNA在轉(zhuǎn)錄本水平的定量問題，筆者提出了一種基于期望最大化（EM）算法估計環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量的方法，并將該定量功能增加到CircAST算法中。該方法以模型為基礎(chǔ)考慮讀段在同一基因的不同環(huán)形轉(zhuǎn)錄本上的分配，選取針對環(huán)形RNA定量的似然函數(shù)，通過期望最大化算法估計參數(shù)的值，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度估計。模擬數(shù)據(jù)的測試結(jié)果表明，無論是絕對定量還是相對定量，算法都表現(xiàn)出了良好的性能，同時，對小鼠睪丸組織中的環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本的定量結(jié)果進(jìn)行qPCR實驗，結(jié)果也驗證了算法定量的準(zhǔn)確性。
隨后，為驗證算法CircAST的實用性，將其應(yīng)用于小鼠兩個典型的生殖腺組織（睪丸和卵巢）的環(huán)形RNA測序數(shù)據(jù)，得到小鼠生殖腺組織中環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜，并篩選出差異表達(dá)的環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本和mRNA轉(zhuǎn)錄本，構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此研究為更好地理解可變剪接事件導(dǎo)致的環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體在哺乳動物睪丸和卵巢中生物學(xué)功能的差異、深入研究睪丸和卵巢內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
最后，基于環(huán)形RNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展中所扮演的重要角色，以膠質(zhì)瘤為例，將CircAST應(yīng)用于人類腦膠質(zhì)瘤腫瘤樣本和癌旁正常樣本環(huán)形RNA測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建人腦膠質(zhì)瘤樣本中環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜，篩選出在膠質(zhì)瘤樣本中顯著上調(diào)和下調(diào)的環(huán)形轉(zhuǎn)錄本，分析可變剪接事件產(chǎn)生的環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本可能的生物學(xué)功能，并構(gòu)建了circRNA介導(dǎo)的競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此工作為探索人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的環(huán)形RNA分子機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)，為人腦膠質(zhì)瘤的臨床診斷和治療確定可能的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供科學(xué)的參考依據(jù)。
本專著研究開發(fā)的算法CircAST為更加精準(zhǔn)地全面解析環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本提供了重要的工具，通過計算不同組織、不同疾病狀態(tài)下環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本完整的序列組成和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以及對環(huán)形RNA基于轉(zhuǎn)錄本水平的精確定量，可以幫助研究者更有效地篩選出具有潛在功能的環(huán)形RNA可變剪接異構(gòu)體，對環(huán)形RNA功能的深入研究具有重要意義。
本著作的研究得到南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)術(shù)著作出版項目、國家自然科學(xué)基金青年項目（No.61901225）、國家自然科學(xué)基金面上項目（No.62273175）的資助，在此表示衷心感謝。
由于我們的理論水平及實踐經(jīng)驗有限，書中疏漏和不足之處在所難免，懇請讀者給予批評指正。

作者
2024年1月

第1章緒論001
1.1環(huán)形RNA概述003
1.2環(huán)形RNA的生物學(xué)功能005
1.3環(huán)形RNA的識別計算010
1.4環(huán)形RNA內(nèi)部結(jié)構(gòu)的探索及定量估計研究013

第2章環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本序列組裝的計算研究019
2.1引言021
2.2基于EMPC算法的環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本序列重構(gòu)方法022
2.2.1基于參考基因組的轉(zhuǎn)錄本組裝022
2.2.2環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本序列組裝024
2.3模擬數(shù)據(jù)驗證027
2.3.1環(huán)形轉(zhuǎn)錄組測序模擬數(shù)據(jù)生成工具027
2.3.2模擬數(shù)據(jù)集030
2.3.3算法性能評估031
2.3.4環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)的復(fù)雜性分析032
2.4實驗驗證034
2.4.1小鼠睪丸環(huán)形RNA測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)備034
2.4.2小鼠睪丸環(huán)形RNA組裝結(jié)果035
2.4.3用RT-PCR和Sanger測序?qū)M裝結(jié)果進(jìn)行驗證038
2.4.4算法對真實數(shù)據(jù)的重構(gòu)效率分析051
2.5與現(xiàn)有算法的比較054
2.6小結(jié)058

第3章環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本定量計算研究061
3.1引言063
3.2基于EM算法的環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本定量計算方法064
3.3模擬數(shù)據(jù)驗證068
3.3.1模擬數(shù)據(jù)集068
3.3.2算法性能評估069
3.4實驗驗證072
3.5與現(xiàn)有算法的比較075
3.6人細(xì)胞系、小鼠睪丸和原雞肌肉中環(huán)形RNA的表達(dá)與分析076
3.7小結(jié)080

第4章小鼠睪丸和卵巢中環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜分析083
4.1引言085
4.2材料和方法088
4.2.1樣本數(shù)據(jù)集的制備088
4.2.2環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本序列組裝和定量分析089
4.2.3環(huán)形RNA可變剪接體的差異表達(dá)分析090
4.2.4功能富集分析090
4.2.5circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建090
4.3結(jié)果091
4.3.1小鼠睪丸和卵巢組織中環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的概貌091
4.3.2小鼠睪丸和卵巢組織中環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)特征099
4.3.3對差異表達(dá)環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的分析103
4.3.4circRNA-miRNA-mRNA相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)111
4.4小結(jié)113

第5章人腦膠質(zhì)瘤樣本中環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜分析115
5.1引言117
5.2材料和方法119
5.2.1樣本數(shù)據(jù)集119
5.2.2環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本序列重構(gòu)和定量分析119
5.2.3差異表達(dá)環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本的鑒定120
5.2.4GO功能富集和KEGG信號通路分析120
5.2.5miRNA預(yù)測和ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建120
5.3結(jié)果121
5.3.1人腦膠質(zhì)瘤樣本中環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的概貌121
5.3.2對照樣本和疾病樣本中環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的特征125
5.3.3環(huán)形轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)分析130
5.3.4circRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)137
5.4小結(jié)139

附錄142
附錄1縮略語142
附錄2小鼠睪丸組織環(huán)形RNA內(nèi)部新的可變剪接事件144
附錄3RT-PCR實驗所用引物信息149
附錄4人類HeLa細(xì)胞系中環(huán)形RNA內(nèi)部新的可變剪接事件154
附錄5人類HEK293細(xì)胞系中環(huán)形RNA內(nèi)部新的可變剪接事件158
附錄6人類Hs68細(xì)胞系中環(huán)形RNA內(nèi)部新的可變剪接事件160
附錄7原雞肌肉組織中環(huán)形RNA內(nèi)部新的可變剪接事件163

參考文獻(xiàn)164